Die Wirksamkeit biosynthetisierter Silbernanopartikel gegen Pseudomonas aeruginosa-Isolate von Mukoviszidose-Patienten

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 8876 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Aufgrund der hohen Antibiotikaresistenz von Pseudomonas aeruginosa (PA) ist die Entwicklung alternativer antimikrobieller Wirkstoffe, die wirksam und erschwinglich sind, von entscheidender Bedeutung. Eine der vielen Anwendungen von Silbernanopartikeln (Ag-NPs) ist ihre Verwendung als antimikrobielles Mittel gegen Bakterien, die gegen gängige Antibiotika resistent sind. Der Hauptzweck dieser Forschung bestand darin, die antibakterielle und antibiofilmwirksame Wirksamkeit biosynthetisierter Ag-NPs gegenüber sechs biofilmbildenden, klinisch isolierten PA-Stämmen und einem Referenzstamm (ATCC 27853) zu bewerten. Ag-NPs wurden unter Verwendung eines Samenextrakts von Peganum harmala als Reduktionsmittel biosynthetisiert. Ag-NPs wurden durch Ultraviolett-Vis-Spektroskopie (UV-Vis) und Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM) charakterisiert. Die Wirkung von Ag-NPs auf die Bildung und Beseitigung von Biofilmen wurde durch Mikrotiterplatten-Assays untersucht und die minimale Hemmkonzentration (MIC) und die minimale bakterizide Konzentration (MBC) bestimmt. Darüber hinaus wurden Echtzeit-Polymerasekettenreaktionen (RT-PCR) durchgeführt, um die Auswirkungen von Ag-NPs auf die Expression von sieben PA-Biofilm-kodierenden Genen (LasR, LasI, LssB, rhIR, rhII, pqsA und pqsR) zu untersuchen. Die biosynthetisierten Ag-NPs waren kugelförmig und hatten einen mittleren Durchmesser von 11 nm. Die MHK für jeden PA-Stamm betrug 15,6 µg/ml, während die MBC 31,25 µg/ml betrug. Alle PA-Stämme, die Ag-NPs in subhemmenden Konzentrationen (0,22–7,5 µg/ml) ausgesetzt waren, zeigten signifikante hemmende Wirkungen auf Wachstum und Biofilmbildung. Der Biomasse- und Biofilmstoffwechsel war abhängig von der Ag-NP-Konzentration reduziert. Die Expression der Quorum-Sensing-Gene aller Stämme war bei einer Ag NP-Konzentration von 7,5 µg/ml deutlich reduziert. Die Ergebnisse belegen die umfassende antibakterielle In-vitro- und Antibiofilmleistung von Ag-NPs und ihr Potenzial bei der Behandlung von PA-Infektionen. Es wird empfohlen, dass zukünftige Studien die mögliche Synergie zwischen Ag-NPs und Antibiotika untersuchen.

Pseudomonas aeruginosa (PA) ist ein häufiger nosokomialer Krankheitserreger, der bei Menschen mit Immunsuppression, bösartigen Erkrankungen, Verbrennungen, traumatischen Wunden und Mukoviszidose zum Tod führen kann1. PA kann auf verschiedenen abiotischen Oberflächen einen Biofilm bilden, darunter künstliche Implantate, Harnkatheter, Endotrachealtuben und Kontaktlinsen2. Extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) bilden die matrixartigen Strukturen von Biofilmen, die die Bakteriengemeinschaften umgeben3. Biofilme sind ein großes Problem, da sie dem Immunsystem des Wirts und vielen antimikrobiellen Mitteln widerstehen können3. Antimikrobielle Peptide werden elektrostatisch von der Biofilmmatrix abgestoßen oder abgebaut, wodurch die Zellen im Inneren vor Phagozytose und der Immunantwort des Wirts geschützt werden4,5. Ein Zell-zu-Zell-Kommunikationssystem namens Quorum Sensing (QS) reguliert mehrere Prozesse in PA, einschließlich der Biofilmproduktion6.

Die Zielzellen vieler antimikrobieller Mittel liegen tief in der Biofilmmatrix verankert, was ihre Behandlung äußerst schwierig macht7. Antibiotikaresistenzen sind heute ein großes globales Gesundheitsproblem8, und der Bedarf an nicht-antibiotischen Behandlungen für arzneimittelresistente mikrobielle Erkrankungen hat erheblich zugenommen. Nanopartikel bieten einen alternativen, einfach zu synthetisierenden Ansatz zur Behandlung von PA-Infektionen, da sie aufgrund ihrer geringen Größe und ihres hohen Oberflächen-Volumen-Verhältnisses wirksam gegen Biofilme sind9.

Von vielen häufig hergestellten Nanopartikeln zeichnen sich Ag-NPs dadurch aus, dass sie über eine hervorragende Fähigkeit verfügen, pathogene multiresistente Bakterienisolate zu bekämpfen10. Es ist allgemein anerkannt, dass Ag-NPs sowohl gegen nicht-resistente als auch gegen resistente pathogene Bakterien eine antibakterielle und antibiofilmaktive Wirkung haben10,11,12. Ag-NPs üben ihre Antibiofilmaktivität aus, indem sie die Peptidoglycanstruktur von Bakterienmembranen erkennen und an die Exopolysaccharidmatrix binden. Die Biofilmstruktur wird dann durch oxidativen Stress und DNA-Schäden, die durch die ROS-Produktion und die Ionenfreisetzung entstehen, schwer beschädigt oder zerstört13,14,15. Ag-NPs haben aufgrund ihres großen Größenbereichs, ihrer Fähigkeit zur Selbstorganisation und ihrer hohen antibakteriellen Aktivität auch ein erhebliches Potenzial für den Einsatz in medizinischen und anderen nichtmedizinischen Anwendungen16.

Die biogen vermittelte Nanotechnologie integriert Prinzipien der grünen Chemie in die Herstellung von Nanopartikeln. Pflanzenextrakte wurden bei der Herstellung metallischer Nanopartikel umfassend untersucht und können deren Monodispersität erhöhen. Die in Pflanzen vorkommenden Biomoleküle (z. B. Flavone, Phenole, Proteine, Polysaccharide, Terpenoide, Alkaloide, Enzyme, Aminosäuren und Alkohole) sind wirksame Reduktionsmittel und dienen als Verkappungsmittel, die die Struktur der NPs stabilisieren und kontrollieren17,18,19,20 . Biogene Techniken bieten einen sauberen und umweltfreundlichen Prozess zur Synthese der Nanopartikel, die in vielen kosmetischen und pharmazeutischen Anwendungen verwendet werden. Daher besteht ein breites Interesse an der Anwendung biogener Techniken zur umweltfreundlichen Herstellung von Nanopartikeln21,22.

Die kahlköpfige und mehrjährige Pflanze Peganum harmala, allgemein bekannt als Harmal, wächst auf sandigen Böden in halbtrockenen Gebieten. Der Strauch ist zwischen 0,3 und 0,8 m lang und enthält kugelförmige Samenkapseln mit mehr als 50 Samen und weißen Blüten. Im Nahen Osten wird diese Pflanze häufig für medizinische Zwecke angebaut und kommt in den Rand- und Wüstenregionen Jordaniens23 vor, wo sie traditionell durch Verbrennen oder Kochen ihrer Samen als Antiseptikum und Desinfektionsmittel verwendet wird24. Die Pflanze wird zur Behandlung verschiedener menschlicher Beschwerden wie Hexenschuss, Asthma, Koliken und Gelbsucht sowie als stimulierendes Mittel zur Emmenagogik eingesetzt25,26. Es wird auch behauptet, dass es antibakterielle, antivirale und antimykotische Eigenschaften hat26,27.

In der aktuellen Studie wurde P harmala als Reduktionsmittel bei der Biosynthese von Ag-NPs verwendet. Die antibakteriellen und antibiofilmischen Eigenschaften der Ag-NPs wurden an klinischen Isolaten von sechs PA-Stämmen untersucht. Die Auswirkungen der Exposition gegenüber unterschiedlichen Konzentrationen von Ag-NPs während der Biofilmbildung wurden ebenfalls bewertet. Darüber hinaus wurde der Einfluss von Ag-NPs auf die Expression von Genen untersucht, die an der QS-Regulation und der Polysaccharidsynthese von PA-Biofilmen beteiligt sind.

In dieser Studie wurden der Standardstamm PA 27853 der American Type Culture Collection (ATCC) sowie sechs klinische Isolate (PA1, PA2, PA3, PA4, PA5 und PA6) verwendet. Der PA-ATCC wurde vom internationalen PA-Gremium bezogen und seine gesamte Genomsequenz ist verfügbar28. Die klinischen Stämme wurden aus Sputumproben von Patienten mit Mukoviszidose im mikrobiologischen Labor des jordanischen Prince Hamza Hospital isoliert. Gram-Färbung, die Synthese grüner Pigmente auf Nähragar, Wachstum auf MacConkey-Agar, der Oxidasetest, Motilität, Wachstum auf Selektivmedium-Cetrimide-Agar und die Fähigkeit, bei 42 °C zu wachsen, wurden zur Identifizierung des PA-Bakteriums herangezogen. Zur Verifizierung wurde das computergestützte automatische Bakterienidentifizierungssystem VITEK2 (Bio Merière, Lyon, Frankreich) verwendet.

Zur Anreicherung der Proben wurde die Brain-Heart-Infusion (BHI)-Bouillon-Technik verwendet (OxoidTM). Nach der Anreicherung wurden die Proben unter Verwendung der Streak-Plate- und Pour-Plate-Ansätze auf Pseudomonas-Cetrimide-Agar (PSA) (OxoidTM) gezüchtet. Für jeden Stamm initiierten die Forscher Subkulturen aus einzelnen Kolonien, die alle aerob auf PSA-Platten bei 37 °C kultiviert wurden. Nach 18–24 Stunden Inkubation wurden frische Kulturen in Konzentrationen von 0,5 auf der McFarland-Skala (1,5 × 108 KBE/ml) hergestellt. Während des Bewertungsprozesses wurden mehrere unterschiedliche Verdünnungen getestet.

Ganze P. harmala-Pflanzen wurden im Juli/2022 im Al-Hallabat-Gebiet des Gouvernements Zarqa auf einer Farm des Landwirtschaftsministeriums gesammelt. Die Identifizierung von P. harmala-Samen wurde durch Vergleich mit der verifizierten Probe im Herbarium der Fakultät für Landwirtschaft der Jordan University of Science and Technology (JUST) überprüft und vom Assistenzprofessor für Landwirtschaft (Dr. Muayyad Bani-Hani) bestätigt. Das Gutscheinexemplar (AM/2023/01/001) wurde im Herbarium der Abteilung für Pflanzenproduktion und -schutz der Universität Jerash, Jordanien, hinterlegt. P. harmala wurden in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetzen geerntet.

Die Samen wurden mit doppelt destilliertem Wasser (Sigma-Aldrich HPLC Plus Water) gewaschen, bei Raumtemperatur gründlich getrocknet und mechanisch zu einem groben Pulver gemahlen. Fünf Gramm dieses Pulvers wurden mit 50 ml bidestilliertem Wasser vermischt und 15 Minuten lang auf 70 °C erhitzt, bevor es zweimal durch Whatman-Filterpapier filtriert wurde. Mithilfe einer Mikrofiltration durch einen 0,22-mm-Spritzenmembranfilter wurde ein klarer wässriger Extrakt mit einem pH-Wert von 5,4 bei 25 °C hergestellt.

Eine 50-ml-Lösung von 3 mM AgNo3 wurde in einem mit Folie bedeckten 100-ml-Erlenmeyerkolben auf 80 °C erwärmt und mit einem Magnetrührer bei einer kontinuierlichen Geschwindigkeit von 1100 U/min gemischt. Wässriger P. harmala-Samenextrakt wurde tropfenweise mit einer Geschwindigkeit von 34 µl/min unter Verwendung einer Mikropipette zugegeben, bis 4 ml zugegeben waren. Eine Änderung der Lösungsfarbe von Orange nach Dunkelbraun war der erste Hinweis auf die Ag-NP-Synthese. Die Lösung wurde dann dreimal 30 Minuten lang bei 6000 U/min zentrifugiert, um nicht umgesetztes P harmala zu entfernen.

UV-sichtbare Spektroskopie (UV-1900, SHIMADZU, Japan) wurde verwendet, um die Bioreduktion von AgNO3 und die Produktion biogener Ag-NPs aus dem wässrigen P. harmala-Extrakt visuell zu verfolgen. Als Kontrollreferenz wurde bidestilliertes Wasser verwendet. Jede spektrophotometrische Analyse wurde in einer Quarzküvette mit einer Schichtdicke von 1,00 cm durchgeführt. Die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) der Ag-NPs wurde mit einem UV-sichtbaren Spektrophotometer gemessen, wobei Wellenlängen von 800–300 nm als Marker für die Ag-NP-Bildung verwendet wurden.

Das Rastertransmissionselektronenmikroskop (STEM) (Versa 3D, FEI, Niederlande) erzeugt Bilder, die von Elektronen stammen, die eine dünne Probe passieren. Dies wurde verwendet, um die Morphologie und Größeneigenschaften der synthetisierten Silbernanopartikel zu testen.

Zur Messung der Röntgenbeugungsspektren (XRD) der Zinkoxid-NPs wurde ein Röntgendiffraktometer verwendet. Dieses war mit einer Strahlungsquelle aus CuKα ausgestattet, die eine Wellenlänge von 0,154 nm aufwies. Der Probenbehälter hatte die Maße 2 cm × 0,5 mm.

Die FT-IR-Analyse der Ag-NPs und des P. harmala-Samenextrakts wurde in der Chemieabteilung der Hashemite University durchgeführt und ermöglichte die Bewertung der Beziehungen zwischen funktionellen Gruppen des P. harmala-Extrakts und der synthetisierten Ag-NPs innerhalb eines Wellenzahlbereichs von 3600–400 cm−1.

Die Scheibendiffusion wurde eingesetzt, um die Anfälligkeit der PA-Stämme gegenüber 10 antipseudomonalen Antibiotika gemäß dem Verfahren des Clinical Laboratory and Standards Institute (CLSI) zu bewerten. Die Zellsuspension in Kochsalzlösung wurde auf 0,5 McFarland eingestellt und in Müller-Hinton-Agar-MHA beimpft, um ein exponentielles Bakterienwachstum zu initiieren (18–24 Stunden) (Sigma-Aldrich). Die Platte wurde mit Antibiotika-Scheiben bedeckt, die dann 18–24 Stunden lang bei 35 ± 2 °C inkubiert wurden. Die bakterielle Anfälligkeit gegenüber diesen Antibiotika wurde durch Messung des Durchmessers der erzeugten Hemmzonen und deren Interpretation gemäß den CLSI-Sollwerten bestätigt29.

Es wurden zehn verschiedene antipseudomonale Antibiotika eingesetzt: Aztreonam 30 µg (ATM), Ciprofloxacin 5 µg (CIP), Piperacillin 100 µg (PRL), Amikacin 30 µg (AK), Ceftazidim 30 µg (CAZ), Cefepim 30 µg (FEP). , Gentamicin 10 µg (CN), Levofloxacin 5 µg (LEV), Imipenem 10 µg (IPM) und Meropenem 10 µg (CT). Alle antipseudomonalen Bandscheiben wurden von Oxoid, Großbritannien, gekauft.

Die MHK eines antimikrobiellen Mittels bezieht sich auf die Mindestkonzentration, die erforderlich ist, um das sichtbare Wachstum der Zielmikroben nach 12-stündiger Inkubation zu unterdrücken. Die minimale bakterizide Konzentration (MBC) bezieht sich auf die Mindestkonzentration, die erforderlich ist, um sicherzustellen, dass nach der Exposition gegenüber dem antimikrobiellen Mittel keine Mikroben lebensfähig bleiben (dh dass in der nachfolgenden Kultur in unbehandelten Medien kein Wachstum beobachtet wird).

Die MHK für die Ag-NPs wurde mithilfe des Mikrotiter-Brühverdünnungsverfahrens30 bestimmt. Die Ag-NPs wurden gegen den ATCC-Referenzstamm PA 27853 und die sechs klinischen Isolate in dreifacher Ausfertigung und in drei separaten Experimenten eingesetzt. In jedem Test wurden 100 μl Bakterien mit einer Dichte von 5 × 105 KBE/ml in Muller-Hinton-Bouillon (MHB) (Oxoid) zu den 96-Well-Testplatten (Corning, NY) gegeben, die unterschiedliche Ag-NP-Konzentrationen enthielten. Als Positivkontrolle wurde PA ATCC 27853 verwendet, während es sich bei der Negativkontrolle um inokulierte Brühe handelte, die unter identischen Bedingungen, jedoch ohne Zugabe von Ag NP, inkubiert wurde.

Die zum Test verwendeten Ag-NP-Konzentrationen lagen zwischen 1 mg/ml und 3,9 μg/ml und wurden durch zweifache Reihenverdünnung erhalten. Die beimpften Mikrotiterplatten wurden einer 24-stündigen Inkubationszeit bei 37 °C und 150 U/min unterzogen. Die Kontrolle wurde 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und enthielt beimpfte Brühe ohne Ag-NPs. Der MIC-Endpunkt bezieht sich auf die minimale Ag-NP-Konzentration, bei der kein erkennbares Wachstum in den Bohrlöchern beobachtet werden konnte. Zur Bestätigung wurde eine Mikrotiterverdünnung auf Tetrazoliumbasis verwendet.

Da zelluläres NADH die Bildung farbiger Formazansalze vorantreibt, werden Tetrazoliumsalze häufig als Reagenzien in biologischen Tests verwendet, um das Stoffwechselverhalten lebender Zellen zu beurteilen31. Farbstoffe auf Tetrazoliumbasis werden daher häufig zur Identifizierung von MICs und zur Bewertung von Biofilmen verwendet32. In dieser Studie wurde Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) als metabolischer Marker für das Überleben von Bakterien und die Entwicklung von Biofilmen verwendet. Nach der ersten 24-stündigen Inkubation wurden 40 μl 0,2 mg/ml TCC, gelöst in entionisiertem Wasser, in die Vertiefungen gegeben und die Inkubation weitere 4–6 Stunden bei 37 °C fortgesetzt. Anschließend wurden die Farbveränderungen beurteilt und mit denen der Kontrollen verglichen.

Die niedrigste Konzentration, die die Farbe des Farbstoffs nicht veränderte, wurde als MHK gegen die Zielbakterien angesehen. Um Zuverlässigkeit zu erreichen, wurde das Experiment jeweils dreimal mit Positiv- und Negativkontrollen wiederholt.

Nach der Ermittlung der Ag-NP-MICs wurden 50-µl-Aliquots aus allen Vertiefungen ausgesät, die kein offensichtliches Bakterienwachstum zeigten. Sie wurden auf BHI-Agarplatten gelegt und 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Eliminierung von 99, 9% der Bakterien durch die niedrigste Konzentration an Ag-NPs als MBC-Endpunkt angenommen (ergänzende Abbildung 1).

Sterile und unbehandelte klare Mikrotiterplatten mit flachem 96-Well-Boden (BD Falcon)33 wurden verwendet, um das Bakterienwachstum und die Biofilmentwicklung unter den verschiedenen Ag-NP-Konzentrationen zu untersuchen. Zur Durchführung des Wachstumstests wurden von jeder PA-Kultur Standardsuspensionen hergestellt. Aliquots von 105 µl Trypton-Soja-Brühe (TSB) wurden auf jede Vertiefung aufgetragen, zu denen 20 µl Aliquots Bakterien gegeben und mit 125 µl unterschiedlicher Konzentrationen an Ag-NPs (0,225–7,5 µg/ml) kombiniert wurden. Dies ergab ein Gesamtvolumen von 250 µl in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte. Alle Tests wurden dreimal durchgeführt. Es wurden auch positive und negative Kontrollen verwendet, wobei erstere PA und TSB (und keine Ag-NPs) und letztere nur TSB enthielten.

Nach Abschluss der Vorbereitung wurden die Kulturen 24 Stunden lang einer aeroben Inkubation bei 37 °C unterzogen, wobei sie im Dunkeln gelagert und geschüttelt wurden. Nach der Inkubation wurden die Zellzahlen bei verschiedenen Konzentrationen von Ag-NPs durch Auswertung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm (Infinite® 200 PRO NanoQuant, TECAN) bestimmt. Der endgültige Zellwachstumswert für jede Ag-NP-Konzentration wurde als Differenz zwischen den Durchschnittswerten der Well-Messwerte mit und ohne PA-Inokulation berechnet. Alle Zellen zeigten eine Biofilm-assoziierte und planktonische Zellexpansion.

Zur Quantifizierung der Biofilmproduktion wurde ein spektrophotometrischer Ansatz verwendet, indem die Gesamtbiomasse gemessen wurde, die Bakterienzellen und EPS umfasst34,35. Für jede Testbedingung wurden parallel zwei unterschiedliche Vertiefungen auf separaten Mikrotiterplatten erstellt. Eine der Vertiefungen wurde dann mit Kristallviolett (CV) und die andere mit dem metabolischen TTC-Farbstoff gefärbt.

Nach 24-stündiger Inkubation der Platte ohne Schütteln (ähnlich einem Wachstumsexperiment) wurde jede Vertiefung abgesaugt und dreimal in steriler physiologischer Kochsalzlösung (250 µl) gewaschen. Nachdem die Vertiefung abgesaugt worden war, wurden die Platten kräftig geschüttelt, um alle ungebundenen Bakterien zu entfernen.

Die restlichen Mikroorganismen auf der ersten Platte wurden in 200 µl 99 % Methanol fixiert. Die Platten wurden 15 Minuten stehen gelassen, danach wurden sie geleert und man ließ sie trocknen. Jede Platte wurde dann 5 Minuten lang mit 2 % Hucker CV, einer Gram-färbesicheren Lösung, gefärbt und in einer Menge von 200 µl auf jede Vertiefung aufgetragen. Um überschüssiges Färbematerial zu entfernen, wurden die Vertiefungen dreimal in 200 µl sterilem Wasser gereinigt. Es wurde darauf geachtet, den Biofilm während der Waschphase nicht zu zerstören. Anschließend wurden die Platten erneut trocknen gelassen, bevor der zellgebundene Farbstoff mit 160 µl 33 % (v/v) Eisessig pro Vertiefung wieder aufgelöst wurde.

Zur Messung der OD-Messungen in den Wells wurde ein automatisches Lesegerät (der ICN Flow Titertek Multiscan Plus) verwendet. Die Ablesungen wurden zu drei verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt: zunächst vor der Inkubation der Proben (OD 600 nm); zweitens Nachinkubation zur Bewertung des Wachstums (OD 600 nm); und drittens nach Abschluss des Biofilmtests (OD 570 nm). Ein Verhältnis von 570/600 wurde verwendet, um die Messung der Biofilmbildung gegenüber dem Bakterienwachstum zu normalisieren. Negative OD-Werte wurden als Null angezeigt. Jedes Experiment wurde dreimal durchgeführt und aus den Standardabweichungen (SDs) wurde ein Grenzwert (ODc) ermittelt. Die verwendete ODc war der Mittelwert der Negativkontrolle + 3 SDs. Die Isolate wurden dann wie folgt in vier Kategorien von Biofilmproduzenten eingeteilt: Nichtproduzent (OD < ODc); schwacher Produzent (ODc < OD < 2 × ODc); mäßiger Produzent (2 × ODc < OD < 4 × ODc); und starker Produzent (4 × ODc < OD).

Die Stoffwechselaktivität wurde auf der zweiten Platte beurteilt, wobei TTC als Marker für das Wachstum lebensfähiger Bakterien diente. TTC wird von stoffwechselaktiven Zellen in ein Formazan-Derivat umgewandelt, das kolorimetrisch leicht zu messen ist. Ähnlich wie bei Wachstumsexperimenten wurden die Platten kräftig geschüttelt, um alle Bakterien zu entfernen, die nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C nicht anhaftend waren.

Nach der Inkubation wurde das Medium aus allen Vertiefungen entfernt und zum Waschen des Biofilms wurden 200 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) verwendet. Die Biofilmzellen aus den Wells mit Biofilm wurden nach Zugabe von 100 µl PBS-Lösung kräftig in die Suspension pipettiert. Der suspendierte Biofilm wurde dann auf eine frische 96-Well-Mikroplatte mit flachem Boden übertragen.

Eine Endkonzentration von 0,02 % wurde durch Zugabe von 50 μl 0,1 % TTC (Sigma, USA) erreicht. Die Proben wurden 4–5 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die OD405 mit einem VERSA max-Mikroplattenlesegerät gemessen. Die kolorimetrische Absorption bei 405 nm ist ein wirksames Mittel zur Quantifizierung der Hemmung des Bakterienwachstums, da rotes Formazan produziert wird, wenn lebensfähige Bakterien TTC36 reduzieren.

Um den Einfluss von Ag-NPs auf die EPS-Produktion zu bewerten, wurde eine modifizierte Ethanol-Fällungsmethode37 verwendet. Die EPS-Extraktion jedes Stammes wurde dreifach durchgeführt. Eine 0,5 McFarland-Bakteriensuspension jedes Stamms in LB-Brühe wurde hergestellt und in 100 ml LB-Brühe mit Ag-NPs in Konzentrationen von 7,5 bis 0,225 μg/ml gegeben und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Kontrolle wurde ohne Zugabe von Ag-NPs hergestellt. Nach der Inkubation wurde EPS aus Bakterienkulturen durch 30-minütiges Zentrifugieren bei 10.000 U/min bei 4 °C extrahiert. Um das EPS auszufällen, wurde 1 Volumenteil 95 %iges Ethanol zu jeweils 3 Volumenteilen des aus der Zentrifuge gesammelten Überstands gegeben und 18 Stunden lang bei 4 °C gekühlt. Die Mischung wurde dann erneut 20 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert, während die Temperatur bei 4 °C gehalten wurde. Das ausgefallene EPS wurde gesammelt und mit bidestilliertem Wasser wieder suspendiert. Eventuelle Spuren von Bakterienzellen wurden aus der Suspension durch Filtration unter Verwendung einer 0,45 μm Celluloseacetatmembran entfernt. Um das Fehlen lebensfähiger Bakterien zu bestätigen, wurde eine Probe unter optimalen Kulturbedingungen auf eine Agarplatte gelegt, um das Wachstum zu überprüfen. Das extrahierte EPS wurde dann lyophilisiert und gewogen, um ein Ergebnis in mg EPS pro 100 ml zu erhalten.

Eine Technik, die CV-Färbung34,35 mit einem stoffwechselempfindlichen Tetrazoliumfarbstoff kombiniert, wurde verwendet, um den Einfluss von Ag-NPs auf vorgebildete Biofilme zu bewerten. Standardisierte Bakteriensuspensionen wurden durch Übernachtkultur in zwei 96-Well-Platten mit TSB in einer Konzentration von 0,5 McFarland hergestellt. Biofilme wurden durch Zugabe von 20 µl Aliquots der Bakteriensuspension zu 250 µl Aliquots TSB (ohne Ag-NPs) erzeugt. Anschließend wurden die Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert, damit der Biofilm wachsen und sich an den Platten festsetzen konnte.

Für jede Bedingung wurden auf einzelnen Mikrotiterplatten zwei separate Vertiefungen erstellt, eine für die Färbung mit CV und die andere für die Färbung mit metabolischem TTC. Am nächsten Tag wurde das Medium von der Platte genommen und 15 Minuten lang auf einem Papiertuch bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Nachdem die planktonischen und nicht anhaftenden Zellen entfernt worden waren, wurde eine Mehrkanalpipette verwendet, um den anhaftenden Biofilm abzuspülen. Dieser Vorgang wurde dreimal mit 150 µl sterilem Medium durchgeführt. Aus jeder Vertiefung wurde überschüssiges Waschmedium abgesaugt, bevor 200 µl frisches MHB mit unterschiedlichen Konzentrationen an Ag-NPs hinzugefügt wurden. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Planktonwachstum untersucht, anschließend wurden die Planktonzellen und das verbrauchte Medium entfernt und die restliche Biomasse dreimal in destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurde eine Platte mit CV und die andere mit TCC gefärbt. Aus den Ergebnissen der drei unabhängigen biologischen Replikate wurden dann durchschnittliche OD490-Werte ermittelt36.

Ein qRT-PCR-Test wurde durchgeführt, um den Einfluss hoher (7,5 µg/ml) und niedriger (0,45 µg/ml) Konzentrationen von Ag-NPs auf die Expression von QS-regulatorischen Genen abzuschätzen. PA wurde in MH-Medium mit den Ag-NPs bei 37 °C und 50–60 U/min in Platten mit 6 Vertiefungen (Corning, NY) inkubiert. Die Kontrollen wurden unter identischen Bedingungen, jedoch ohne Ag-NPs, inkubiert. Nach 24–48-stündiger Exposition (exponentielle Phase des Biofilmwachstums) wurde der Biofilm vorsichtig geerntet und vorsichtig mit 10 mM NaCl gespült, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Biofilm-RNA wurde mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Deutschland) extrahiert.

Um die cDNA zu synthetisieren, wurden Zufallsprimer (einschließlich RNaseOUT, dNTPs und Superscript II-Reverse-Transkriptase (Tsingke, Peking, China) einer Reverse-Transkriptions-PCR-Reaktion bei 42 °C unterzogen. Quantitative Polymerasekettenreaktionen (qPCR) wurden unter Verwendung eines BIO-RAD Thermal durchgeführt Cycler, um eine Amplifikation zu erreichen. Anschließend wurden 2 μl Template-DNA zu einer 0,5 μl-Lösung jedes Vorwärts- und Rückwärtsprimers, 10 μl Luna Universal qPCR Master Mix und 7 μl nukleasefreies Wasser hinzugefügt, um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 20 μl zu ergeben .

Für alle in dieser Studie verwendeten PCR-Primer wurde eine Gradienten-PCR-Reaktion durchgeführt. Die Zyklenbedingungen wurden einer Vordenaturierung bei 95 °C für 3 Minuten unterzogen, danach wurden 34 Zyklen der Denaturierung bei 94 °C jeweils 30 Sekunden lang durchgeführt und bei einem Temperaturbereich zwischen 50 und 63 °C 30 Sekunden lang getempert . Anschließend erfolgte eine 60-sekündige Elongation bei 72 °C. Abschließend wurde die Reaktion für 5 Minuten bei einer Temperatur von 72 °C verlängert. Die relativen Expressionswerte der QS-regulatorischen Gene wurden auf die Housekeeping-Gene rpoD und rpsL normalisiert und die spezifische PCR-Amplifikation mittels Agarosegelelektrophorese verifiziert. Für die behandelte PA wurde das Genexpressionsniveau im Verhältnis zu dem der unbehandelten PA berechnet. Hierzu wurde die 2−ΔΔCt-Technik eingesetzt38. Die in dieser Forschung verwendeten Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Die HT29-MTX-Zelllinie wurde verwendet, um die Zytotoxizität von Ag-NPs mithilfe des Methyltetrazolium (MTT)-Assays zu bewerten39. HT29-MTX stammt aus den Becherzellen des Dickdarms, sondert jedoch das Mucin MUC5AC ab, das für die Becherzellen in Zellen des Atmungssystems charakteristisch ist, und nicht das für die Becherzellen im Dickdarm charakteristische MUC2-Mucin. HT29-MTX-Zellen wurden in T75-Kolben mit 10 % CO2 bei 37 °C in 12 ml Dulbeco Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma, UK) unter Zusatz von 10 % FCS (Sigma, UK), 50 U/ml Penicillin, kultiviert. 50 mg/ml Streptomycin (Sigma, UK), 50 mg/ml Gentamycin (Lonza, USA) und 50 µg/ml Amphotericin B (Lonza, USA).

Die HT29-MTX-Zellen wurden dann 24 Stunden lang in serumfreiem DMEM mit 50 U/ml Penicillin, 50 mg/ml Streptomycin, 50 mg/ml Gentamycin und 50 µg/ml Amphotericin B ruhen gelassen. Anschließend wurden Ag-NPs in Konzentrationen von 7,5 zugegeben –0,225 µg/ml. Die mit Ag-NP behandelten Zellen und die Kontrollzellen wurden 24 Stunden lang mit 5 % CO2 bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95 % inkubiert. Anschließend wurde das Medium entfernt und die Zellen mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Vertiefungen mit 25 ml MTT-Lösung (5 mg/ml) versetzt und 4 Stunden lang inkubiert. Das Medium wurde entfernt und durch 100 ml DMSO ersetzt und 15 Minuten lang leicht gerührt. Um die Wirkung der Ag-NPs auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten, wurde das Plattenlesegerät für enzymgebundene Immunosorbens-Assays verwendet, um die Absorption bei 570 nm zu messen und den Prozentsatz lebensfähiger Zellen für die mit Ag-NP behandelten Zellen und die Kontrollzellen zu schätzen38.

Die Hashemite University und das Ethics Service Committee des Prince Hamza Hospital erteilten dieser Fallstudie eine ethische Genehmigung (Referenznummer 7/10/2019-2020). Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Die klinischen PA-Isolate aus den Sputumproben wurden nach Einholung der Einverständniserklärung aller CF-Patienten entnommen.

Der Mittelwert (M) und der Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von mindestens drei Wiederholungen wurden verwendet, um die experimentellen Ergebnisse auszudrücken. Zur Identifizierung der Unterschiede zwischen den Proben und den Kontrollen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) verwendet. Die OD-Werte aus den Mikrotiterplatten-Experimenten (mit und ohne Nanopartikel) bei verschiedenen Verdünnungen wurden mit dem Tukey-Test verglichen. P-Werte unter 0,05 wurden als signifikant angesehen. Die Daten wurden mit der Software Graphpad Instat 6.0 untersucht.

Während der Herstellung von Ag-NPs führt die Bildung von Ag-NPs zu einer Farbänderung im Reaktionsgemisch von Orange nach Dunkelbraun, was auf eine AgNO3-Reduktion durch die Anregung der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) in den Ag-NPs hinweist (ergänzende Abbildung 2). Das UV-Vis-Spektrum (dargestellt in Abb. 1A) zeigt einen breiten Absorptionspeak bei etwa 461 nm, was mit der Ag-Oberflächenplasmonresonanz übereinstimmt, die zwischen 450 und 500 nm auftritt.

(A–E) Das UV-sichtbare Spektrum synthetisierter Ag-NPs (A). Die STEM-Bilder für synthetisierte Ag-NPs, Vergrößerung bei 300-fach (B) und bei 200 nm (C). Die Größenhistogramme der Ag-NPs (D), XRD-Muster der synthetisierten Ag-NPs (E).

Das STEM-Bild der Ag-NPs, die mit P. harmala-Samenextrakt synthetisiert wurden, ist in Abb. 1 zu sehen. Das Dunkelfeldbild in Abb. 1B zeigt, dass es sich um biosynthetisierte Ag-NPs mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von etwa 11 nm handelte. Darüber hinaus verdeutlicht das in Abb. 1C dargestellte Hellfeldbild für Ag-NPs die Gleichmäßigkeit der synthetisierten Partikel, ihre Kugelform und das Fehlen einer Aggregation. Die Größenhistogramme der Ag-NPs sind in Abb. 2D dargestellt. Die Histogramme zeigen, dass die Hauptpartikelgrößen der in dieser Untersuchung hergestellten Ag-NPs etwa 10,9 ± 2,7 nm betragen.

Die FT-IR-Spektren: (A) P. harmala-Extrakt. (B) Synthetisierte Ag-NPs.

Das XRD-Muster der zuvor vorbereiteten Silbernanopartikelprobe wurde beim UGC-DAE Consortium for Scientific Research, Indore, dokumentiert. Zu diesem Zweck wurde ein Bruker d8 Advance Röntgendiffraktometer verwendet. Die folgenden Parameter wurden angewendet: Strahlungsquelle, CuKα, λ = 1,5406 Å; 40 kV–40 mA; Scanmodus, 2θ/θ.

Es wurde ein Vergleich zwischen dem in Abb. 1 gezeigten Diffraktogramm und der JCPDS-Standard-Leistungsbeugungskarte, Silberdatei Nr. 04-0783, durchgeführt. Vier Peaks wurden bei 2θ-Werten erkannt, d. h. 38,2901°, 44,5583°, 64,8185° und 77,4383°, die vermutlich das Silbermetall und die zugehörigen Silberebenenwerte von hkl widerspiegeln, d. h. (111), (200), (200). ) bzw. (311). In Abb. 1D.

FT-IR wurde verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen Ag-Atomen und bioaktiven Chemikalien zu identifizieren, die sich auf die Stabilität von Ag-NPs auswirken (Abb. 2). Ähnliche Peaks der FT-IR-Spektren mit einer leichten Verschiebung sind in den biosynthetisierten Ag-NPs und den P. harmala-Extrakten zu sehen. In Abb. 2A,B repräsentieren unterschiedliche Pfeilfarben unterschiedliche funktionelle Gruppen. Das Gelb bezeichnet den Peak bei 3533,98 cm−1 für das P. harmala-Extraktspektrum, der sich für das Ag-NPs-Extraktspektrum in 3318,33 cm−1 änderte und der OH-Streckung von Hydroxylgruppen, einschließlich Alkoholen, Phenolen usw., zugeordnet wurde die NH-Gruppe von Aminen oder Amiden. Das Rot stellt den Peak bei 1608,36 cm-1 für das P. harmala-Extraktspektrum dar, der sich für das Ag-NPs-Extraktspektrum in 1629,49 cm-1 änderte und der C=O-Gruppe der Carbonsäuren zugeordnet wurde. Schließlich zeigt der grüne Pfeil den Peak für das P. harmala-Extraktspektrum bei 725,87 cm−1 an, der sich für das Ag-NPs-Extraktspektrum in 888,70 cm−1 änderte und C=CH2 zugeordnet wurde.

Die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika wurde mithilfe des Scheibendiffusionsansatzes bewertet. Vier klinische Isolate (PA2, PA4, PA6 und PA5) zeigten eine mittlere Resistenz gegen eines (Gentamicin), zwei (Imipenem und Levofloxacin), vier (Imipenem, Gentamicin, Levofloxacin und Ciprofloxacin) und fünf der in dieser Studie eingesetzten Antibiotika (Meropenem, Gentamicin, Amikacin, Levofloxacin und Ciprofloxacin). Drei klinische Isolate (PA3, PA5 und PA6) erwiesen sich als resistent gegen Cefepim. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass keines der Isolate multiresistent (MDR) war. Ergänzende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Antibiotika-Empfindlichkeitstests für ATCC und die klinischen Stämme, wobei PA5 die höchste Resistenz gegen alle untersuchten Antibiotika aufweist.

Nach 24-stündiger Inkubation der Proben bei 37 °C unter aeroben Bedingungen und mit Ag-NPs in Konzentrationen von 3,9 bis 1000 μg/ml war in den Reagenzgläsern mit 3,9–7,8 μg/ml Ag-NPs eine Trübung vorhanden. Diese Trübung deutete darauf hin, dass bei diesen Ag-NP-Konzentrationen Bakterien wuchsen. Bei Konzentrationen von 15,6–1000 µg/ml konnte jedoch keine Trübung festgestellt werden, was auf eine Hemmung des Bakterienwachstums schließen lässt. BHI-Agarplatten wurden mit den Suspensionen aus den Röhrchen von 15,6–1000 µg/ml über einen Zeitraum von 24 Stunden beimpft. Bei Konzentrationen von 31,25–1000 µg/ml konnten keine Bakterien gesehen werden, was bestätigt, dass die Ag-NPs bakterizid waren. Aus diesen Ergebnissen geht somit hervor, dass die MHK und der MBC von Ag-NPs für alle PA-Stämme 15,6 bzw. 31,25 µg/ml betrugen.

Die Mikrotiterplattentests zeigten, dass alle Stämme starke Biofilmproduzenten waren (weitere Einzelheiten siehe Ergänzungstabelle 3). Ag-NPs in Konzentrationen von 0,225 bis 7,5 µg/ml wurden verwendet, um die antibakterielle Aktivität von Ag-NPs gegenüber den PA-Stämmen (Referenzstamm und sechs klinische Stämme) mit Resistenz gegen verschiedene Antibiotika zu bewerten. Trotz der Unterschiede zwischen verschiedenen Stämmen hatte die Inkubation von PA-Stämmen mit Ag-NPs in Dosen von 0,22 bis 7,5 g/ml einen negativen Einfluss auf das Wachstum (Abb. 3). Bei Konzentrationen von 0,9–7,5 µg/ml wurde festgestellt, dass Ag-NPs bei vier der PA-Stämme (ATCC, PA1, PA2, PA6) einen signifikanten Rückgang des Wachstums (P < 0,05) hervorrufen. Die Stämme PA3, PA4 und PA5 wurden bei Konzentrationen über 1,8 µg/ml erheblich beeinträchtigt (F (3,013, 11,08) = 61,93, P < 0,0001). Konzentrationen darunter wirkten sich negativ auf das Wachstum aller Stämme aus, obwohl dies statistisch nicht signifikant war. Bei 0,225 µg/ml kam es jedoch zu einem Anstieg des Wachstums bestimmter PA-Stämme (ATCC, PA1, PA5 und PA6).

Der Einfluss von Ag-NPs auf das PA-Planktonwachstum nach 24-stündiger Inkubation, angezeigt durch die Absorption bei 600 nm (y-Achse) für den ATCC-Stamm und sechs klinisch isolierte Stämme (PA1–PA6) bei Konzentrationen von Ag-NPs von 0,22 bis 7,5 µg/ ml (x-Achse). ****< 0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01.

Die Biofilmentwicklung von drei Stämmen (ATCC, PA2, PA6) wurde durch Ag-NPs bei Konzentrationen von 0,45 µg/ml oder mehr erheblich beeinflusst (F (1,931, 11,39) = 17,12, P = 0,0009). Erst Konzentrationen von 0,9 µg/ml und mehr hatten einen wesentlichen Einfluss auf PA1 und PA3. Konzentrationen von 1,8 µg/ml oder mehr reduzierten die Biofilmbildung der resistenteren Stämme von PA4 und PA5 deutlich (Abb. 4).

Der Einfluss von Ag-NPs auf die Biofilmentwicklung für den ATCC-Stamm und sechs klinisch isolierte Stämme (PA1-PA6) nach 24-stündiger Inkubation bei Ag-NP-Konzentrationen von 0,22 bis 7,5 µg/ml (x-Achse). ****< 0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01.

Die Analyse des PA-Metabolismus in Biofilmen ergab einen statistisch signifikanten Rückgang der PA-Spiegel im Vergleich zur Kontrolle (F (2,757, 16,94) = 43,30, P < 0,0001) (Abb. 5). Der Biofilmzellstoffwechsel von TCC, ATCC, PA1, PA2 und PA6 wurde durch 0,9 µg/ml Ag-NPs signifikant gehemmt. Signifikante Auswirkungen auf PA3 und PA4 wurden bei Konzentrationen von 1,8 µg/ml und höher beobachtet. Es wurde festgestellt, dass der PA5-Stamm erst bei Konzentrationen über 3,75 µg/ml signifikant beeinträchtigt wurde. Dennoch wurde die Stoffwechselaktivität der Biofilmzellen von PA5 bei allen Ag-NP-Konzentrationen erheblich beeinflusst.

Einfluss von Ag-NPs auf die Stoffwechselaktivität von PA-Planktonzellen, angezeigt durch Absorption bei 600 nm (y-Achse) 4 Stunden für den ATCC-Stamm und sechs klinisch isolierte Stämme (PA1-PA6) bei Konzentrationen von Ag-NPs von 0,22 bis 7,5 µg /ml (x-Achse). ****0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01.

Im Vergleich zu den Krankenhausstämmen zeigte der Referenzstamm eine höhere Empfindlichkeit gegenüber allen untersuchten Ag-NP-Konzentrationen. Die niedrigeren Konzentrationen an Ag-NPs, die erforderlich sind, um den ATCC-Stamm signifikant zu beeinflussen, stützen die Ergebnisse der Antibiotikatests, bei denen festgestellt wurde, dass er gegenüber allen getesteten Antibiotika empfindlich ist.

Die Wirkung von Ag-NPs auf die EPS-Produktion wurde untersucht, indem die PA-Stämme ohne Ag-NPs oder mit subinhibitorischen Konzentrationen von Ag-NPs kultiviert wurden. Das Trockengewicht des nach der Kultur extrahierten EPS war in den mit Ag NP behandelten Zellen signifikant niedriger als in den Kontrollzellen (F (6, 42) = 8,38, P ≤ 0,0001). Abbildung 6 zeigt, dass das Gewicht des aus PA ATCC, PA1, PA3 und PA6 extrahierten EPS deutlich geringer war als das der Kontrolle, wenn sie in Gegenwart von Ag-NP-Konzentrationen von oder über 0,9 µg/ml gezüchtet wurden. Für PA2, PA4 und PA5 waren die Verringerungen der EPS-Produktion bei Ag-NP-Konzentrationen von 1,8 µg/ml oder mehr statistisch signifikant.

Einfluss von Ag-NPs auf die Biofilm-EPS-Produktion, angezeigt durch das Trockengewicht von EPS (mg/100 ml) für den ATCC-Stamm und die sechs klinischen Isolate (PA1-PA6) bei Ag-NP-Konzentrationen von 0,22 bis 7,5 µg/ml (X-Achse). ). ****0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ag-NPs auch die CV-gefärbte PA-Biomasse in den Eradikationstests, mit denen die Behandlung von 1 Tag alten vorgebildeten Biofilmen bewertet wurde, deutlich reduzierten (F (20, 66) = 9,148, P = 0,0001). Gleichzeitig hemmten Ag-NPs die Stoffwechselaktivität reifer Biofilme. Abbildung 7 zeigt, dass zwei der Stämme (ATCC, PA6) bei Konzentrationen über 0,9 µg/ml einen statistisch signifikanten Rückgang der CV-Färbebiomasse zeigten. Auch drei Stämme (PA1, PA2, PA3) wurden durch eine Ag NP-Konzentration von 1,8 µg/ml deutlich gehemmt. Die erhebliche CV-Färbung von PA4 und PA5 wurde bei Konzentrationen über 3,75 µg/ml deutlich reduziert.

Der Einfluss von Ag-NPs auf die Beseitigung reifer Biofilme nach 24-stündiger Inkubation bei Konzentrationen von 0,22 bis 7,5 µg/ml (x-Achse), angezeigt durch OD bei 570 nm (y-Achse). (****0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01).

Der Metabolismus der vorgebildeten Biofilmgemeinschaft von PA-Stämmen, die mit Ag-NPs inkubiert wurden, wurde signifikant gehemmt (F (6, 7) = 15,32, P = 0,001). In den Stämmen PA2 und PA3 hemmten Ag-NP-Konzentrationen von 0,9 µg/ml die Stoffwechselaktivität signifikant, es waren jedoch Konzentrationen von 1,8 µg/ml oder mehr erforderlich, um die Stoffwechselaktivität von ATCC, PA1, PA5 und PA6 signifikant zu hemmen. Erst Konzentrationen von 3,75 µg/ml und höher hatten einen signifikanten Einfluss auf die PA4-Stoffwechselaktivität (Abb. 8).

Einfluss von Ag-NPs auf die Stoffwechselaktivität reifer Biofilmzellen mittels TCC-Färbung nach 24-stündiger Inkubation mit Ag-NP-Konzentrationen von 0,22 bis 7,5 µg/ml (x-Achse). Dies wird durch OD bei 570 nm (y-Achse) angegeben (< 0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01).

Berechnete Ct-Werte wurden verwendet, um die entsprechenden Ausdrücke der QS-regulierten Gene lasI, lasR, rhlI, rhlR, pqsR und pqsA zu bestimmen. Die Genexpressionen wurden zunächst relativ zum Durchschnitt des RopD-Referenzgens standardisiert. Abbildung 9 vergleicht die relative Expression von QS-regulierten Genen im PA-Stamm, der biosynthetisierten Ag-NPs (in Konzentrationen von 7,5 µg/ml und 0,45 µg/ml) ausgesetzt war, mit den Kontrollproben, die ohne Ag-NPs kultiviert wurden. Wie Abb. 7 zeigt, reduzieren Ag-NPs die Expression von QS-regulatorischen Genen. Im Vergleich zur Kontrolle, bei der eine Genexpression von 100 % angenommen wird, zeigen alle bis auf zwei PA-Stämme, die 24 Stunden lang mit 7,5 µg/ml Ag-NPs kultiviert wurden, deutlich reduzierte QS-regulierte Genexpressionen. Die beiden Ausnahmen (LasR in PA3 und LasI in PA4) zeigten eine Verringerung der Expression, diese war jedoch statistisch unbedeutend.

Die Wirkung von Ag-NPs auf die Expression von QS-regulierten Genen in PA-Stämmen, die biosynthetisierten Ag-NPs ausgesetzt waren, im Vergleich zur Genexpression von Kontrollen, die keinen Ag-NPs ausgesetzt waren. Ag-NP-Konzentrationen von 7,5 µg/ml und 0,45 µg/ml. *< 0,01.

Der Prozentsatz der Hemmung variierte zwischen den Stämmen und zwischen den verschiedenen Genen (Tabelle 1). Im Vergleich zur Kontrollprobe war bei 7,5 µg/ml Ag NPs die relative Expression des Las-Gensystems in allen Stämmen deutlich reduziert. Der Rückgang bei LasR, LasB und LasI lag zwischen 25,7 und 63,3 %, 13,2 und 51,4 % bzw. 15,7 und 69,4 %. Bei Konzentrationen von 7,5 µg/ml zeigten sowohl die rhIR- als auch die rhII-Genexpression statistisch signifikante Rückgänge im Bereich von 19,7 bis 43,8 % bzw. 16–40,3 %. Darüber hinaus war bei der hohen Konzentration die Expression von PqsA und PqsR im Vergleich zu den Kontrollen erheblich verringert.

Bei der Ag NP-Konzentration von 0,45 µg/ml gab es auch einige statistisch signifikante Auswirkungen auf die relative Expression bestimmter Gene. Gene des Las-Systems waren am stärksten betroffen, wobei die relative Expression des LasR-Gens in 4 Stämmen (ATCC, PA1, PA2 und PA 6) statistisch reduziert war. Die LasI-Genexpression war bei ATCC und PA1 signifikant reduziert, während LasB nur bei PA1 eine signifikante Reduktion zeigte. Abgesehen von der rhII-Genexpression in PA3 gab es keinen statistisch signifikanten Einfluss der 0,45 µg/ml Ag NP-Konzentration auf das RhI- und pqs-System.

MTT-Assays wurden für das erste Screening der Ag NP-Zytotoxizität bei den HT29-MTX-Krebszelllinien verwendet. Die HT29-MTX-Zelllinie zeigte bei allen verwendeten Konzentrationen eine hohe Resistenz gegen Ag-NPs, ohne statistisch signifikante Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen (F (6, 14) = 0,2871, P = 0,9334). Dennoch verringerte sich die Lebensfähigkeit der Zellen von 4,1 % bei einer Ag-NP-Konzentration von 7,5 µg/ml auf 0,2 % bei 0,225 µg/ml (Abb. 10).

Der Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen von Ag-NPs auf die Lebensfähigkeit der menschlichen HT29-MTX-Zelllinie nach 24-stündiger Inkubation. Die relative Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit der Kontrolle verglichen (getestet/Kontrolle × 100). Das Experiment wurde dreimal in Duplikaten durchgeführt.

Biofilmbildende Mikroben sind für viele Krankheiten verantwortlich. Eine von den National Institutes of Health und dem Center of Disease Control durchgeführte Studie ergab, dass biofilmbildende Mikroben zwischen 65 und 80 % der Infektionen verursachten40. Viele Studien haben gezeigt, dass NPs als wirksame Biofilminhibitoren gegen Zielbakterien dienen41,42. Darüber hinaus haben wir in früheren Arbeiten herausgefunden, dass ZnO-Nanopartikel eine entscheidende Rolle dabei spielen, der Entwicklung von Biofilm in biofilmbildendem PA43 entgegenzuwirken. Die aktuelle Studie konzentrierte sich auf die Verwendung von P. harmala in der Ag-NP-Synthese, da davon ausgegangen wurde, dass dies sowohl biologische als auch wirtschaftliche Vorteile hat. Die Ergebnisse unterstreichen die signifikanten Anti-QS-, antibakteriellen und Antibiofilm-Eigenschaften biosynthetischer Ag-NPs.

Chemische Reduktion ist einer der Prozesse zur Herstellung von Ag-NPs44,45. Reduktionsansätze gelten als einfacher und kostengünstiger als andere alternative Methoden46. Darüber hinaus wird dringend empfohlen, für die Synthese von Ag-NPs umweltfreundliche Techniken zu verwenden (d. h. grüne Syntheseansätze, die sowohl Pflanzen als auch Mikroorganismen einbeziehen)47. In der aktuellen Studie wurden Reduktionsmittel aus pflanzlichen Sekundärmetaboliten zur Herstellung der NPs48 verwendet. Ag-NPs wurden mithilfe verschiedener Pflanzen biosynthetisiert und verschiedene biologische Prozesse untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde Pharmala verwendet, ein Kraut mit vielen phytochemischen Bestandteilen, die in der traditionellen Medizin weit verbreitet sind49.

Unsere Studie ergab, dass sich während der Biosynthese Ag-NPs zu entwickeln beginnen, wenn Silbernitrat P haramla-Samenextrakt ausgesetzt wird. Dies wurde durch Farbveränderungen und den Einsatz von UV-Vis-Spektroskopie bestätigt. Die biosynthetisierten Ag-NPs zeigten aufgrund ihrer SPR-Eigenschaften eine starke Absorptionsbande bei 461 nm. Die Verringerung und Stabilität von Silbernanopartikeln kann durch Wechselwirkungen zwischen Silberatomen und bioaktiven Chemikalien verursacht werden50, und diese wurden mithilfe der FT-IR-Analyse untersucht. Ähnliche Peaks waren in den FT-IR-Spektren des P. harmala-Extrakts zu erkennen, der zur Synthese der Ag-NPs verwendet wurde, obwohl es auch kleine Verschiebungen in beiden Spektren gab. Die Spektren der auf Samenextrakten basierenden Ag-NPs zeigten einen Bereich von Absorptionsbanden zwischen 1642 und 3351 cm−1. Dies weist darauf hin, dass das Biomolekül die Fähigkeit besitzt, Silberionen (Ag+, Ag0) in Ag-NPs zu reduzieren und zu stabilisieren, wenn es in wässrigen Samenextrakt gegeben wird.

Eine zusätzliche TEM-Detektion ergab, dass diese Partikel eine ungefähr kugelförmige Form und eine einheitliche Größe hatten, mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 11 nm. Die antibakteriellen Eigenschaften von Ag-NPs korrelieren negativ mit ihrer Partikelgröße und sind umso schwächer, je größer der Durchmesser ist51. Laut Choi et al.52 können Ag-NPs, die kleiner als 15 nm sind, in das Bakterium eindringen und wesentlich stärkere antibakterielle Wirkungen ausüben als solche mit einer Größe von 15–20 nm. Partikel von 1–15 nm können an der Oberfläche der Bakterien haften.

Wir haben unsere Ag-NPs verwendet, um ihre bakterizide Wirksamkeit gegen PA zu testen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Ag-NPs bei niedrigen Konzentrationen eine starke antibakterielle Wirkung auf PA hatten, wobei die MHK und MBC zwischen 15,6 und 31,25 µg/ml lagen. Es wurde berichtet, dass die MHK der Ag-NPs für PA zwischen 0,59 und 50 µg/ml liegt53,54,55,56,57,58,59,60. Die große Bandbreite an MHK-Werten, die in verschiedenen Studien gefunden wurden, ist darauf zurückzuführen, dass Unterschiede in den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Nanopartikel (d. h. Form, Größe und Vorhandensein von Oberflächeneinheiten) einen erheblichen Einfluss auf ihre antibakterielle Aktivität haben51. Die MHK unserer Ag-NPs stimmt mit dem unteren Bereich bekannter MHKs überein, was wahrscheinlich auf ihre relativ kleine Partikelgröße zurückzuführen ist. Daher konnten wir das Wachstum von PA durch den Einsatz geringer Konzentrationen an Ag-NPs wirksam verhindern. Die hemmende Wirkung von Ag-NPs auf Escherichia coli (E. coli) und Staphylococcus aureus (S. aureus) wurde von Azizi et al.60 untersucht, die sie auch unter Verwendung von P. harmala synthetisierten. Obwohl die erzeugten Ag-NPs größer waren (23 nm), zeigten sie dennoch eine moderate Hemmwirkung – ein weiterer Beweis für die Wirksamkeit von Ag-NPs gegen pathogene Bakterien. Die Auswirkungen des Ag-NP auf PA wurden von diesen Autoren jedoch nicht untersucht.

In dieser Studie wurde auch der Mikrotiterplattentest durchgeführt, um die Hemmung der Biofilmbildung in PA in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von Ag-NPs zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass es tatsächlich eine statistisch signifikante Hemmung der Biofilmbildung (Abb. 3, 4) sowie eine Verringerung des EPS (Abb. 6) gab. Unsere Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Studien von Haidari et al.61, die den Einfluss von Ag-NPs auf die Biofilmproduktion in verschiedenen Bakterien untersuchten und herausfanden, dass Ag-NPs in einer Konzentration von 45 µg/ml die Biofilmbildung von S. hemmen können . aureus um 89 % und von E. coli um 75 %.

Die Wirksamkeit von Ag-NPs (Größe 7–70 nm) gegen den PA-ATCC-Stamm PAO1 wurde auch von Loo et al.62 nachgewiesen, die zeigten, dass der Abbau der EPS-Matrix zu einer 95-prozentigen Reduzierung der Biofilmbildung durch PA führte. Ag-NPs können erhebliche strukturelle Schäden an bakteriellen Biofilmen verursachen. Dies lässt sich an der veränderten Morphologie der Biofilme erkennen, die auf Zelllyse14, Zellwandschäden und die Störung der Membranwellung und Membranpolarisation/-permeabilität zurückzuführen ist. Bestimmte Bakterienstämme bilden auch spezifische EPS-Matrizen, die sie umschließen15. Die Ag-NPs interagieren elektrostatisch mit Bakterienmembranen und dies kann stark genug sein, um die Membranen aufzubrechen und den NPs das Eindringen in den reifen Biofilm zu ermöglichen. Eine von Haney et al.63 durchgeführte Studie stand jedoch im Widerspruch zu unseren Erkenntnissen und ergab, dass die Behandlung von Zellen mit superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln in einer Dosierung von 200 µg/ml die Biomasse des PA-Biofilms erhöhte. Dieser Effekt wurde durch die Tatsache erklärt, dass Zellen möglicherweise Eisennanopartikel verwenden, um elementares Eisen bereitzustellen, was zu der beobachteten Zunahme der Zelldichte und der Entwicklung von Biofilm-Biomasse führt – ein Prozess, der im Fall von Ag-NPs nicht verfügbar ist.

In unserer Studie konnten Ag-NPs die Biomasse etablierter Biofilme reduzieren. Allerdings sind höhere Konzentrationen erforderlich, um eine statistisch signifikante Reduzierung zu erreichen, als für eine signifikante Beeinflussung der frühen Biofilmbildung erforderlich ist – was die Ansicht bestärkt, dass die primäre Funktion von Biofilmen die Schutzfunktion ist64,65. Laut Said et al.65 sind die Biofilmzellen viel anfälliger für Ag-NPs (gemessen durch Mikrokalorimetrie), wenn die Biofilmmatrix durch Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Benzethoniumchlorid (BC) aufgebrochen wird.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass Ag-NPs die Stoffwechselaktivität von PA im reifen Biofilm reduzierten, was mit den von Li et al.66 und Kim et al.67 vorgeschlagenen Wirkmechanismen übereinstimmt. Ag-NPs haben die Fähigkeit, in Zellen einzudringen und deren Peptidoglycan, Periplasma und äußere Membranen zu passieren. Hier zerstören sie die Dehydrogenasen der Atmungskette und verändern den Gehalt an gelöstem Sauerstoff66,67. Darüber hinaus könnten Wechselwirkungen zwischen Ag+ und der Thiolgruppe (–SH) von Cysteinen stattfinden, um –S–Ag zu erzeugen. Dies wiederum würde die Entwicklung hemmen und die enzymatische Aktivität der Bakterienzellen unterdrücken66,68.

Die bakterielle Pathogenität und die Fähigkeit zur Biofilmbildung werden durch das QS-Netzwerk69 gesteuert, das Transkriptionsregulatoren enthält, die durch ihre natürlichen Autoinduktoren (d. h. las und rhl22) aktiviert werden. Neben der Regulierung von Virulenzmerkmalen steuert QS auch die Fähigkeit zur Bildung von PA-Biofilmen. Studien von Solano et al.70 und Brindhadevi et al.69 zeigten, dass PA mit mutiertem lasR und lasI Biofilme erzeugt, die weniger wirksam sind und durch antimikrobielle Mittel leicht entfernt werden können. Exopolysaccharide und andere Substanzen, die die Form wachsender Gemeinschaften regulieren, werden von Genen kodiert, die QS aktiviert40.

Eine Reihe von Systemen spielen eine Rolle bei der Koregulierung der Biofilmbildung im gesamten PA-System, darunter die Systeme las, rhl und pqs. Während LasI und RhlI die Autoinduktorsynthese regulieren, sind lasR und rhlR hauptsächlich an der Kodierung von Transkriptionsaktivatoren beteiligt71. Ag-NPs können die Las- und Rhl-Wege stören und die Produktion von Signalmolekülen verhindern, wodurch die Bildung von Biofilmen in PA aufgrund der Anti-QS-Wirkung verhindert wird64,72. In der vorliegenden Arbeit wurde bei der Behandlung von Bakterienzellen mit den Ag-NPs die Expression vieler wichtiger Gene der QS-Systeme las, rhl und pqs (lasR, lasI, lasB, rhlI, rhlA, pqsR und pqsA) deutlich verringert im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 9 und Tabelle 1).

Es wurde vermutet, dass Ag-NPs das primäre QS-System von PA stören könnten. Dennoch ist es wichtig zu beachten, dass die Entwicklung von Biofilmen ein dynamischer Prozess ist und die QS-Produktion einer irreversiblen Bakterienanheftung sowie der Zellvermehrung und -expansion nach der Inokulation folgt. Infolgedessen war in den ersten Phasen der Biofilmentwicklung die hemmende Wirkung von Ag-NPs auf Biofilm-Biomassen durch Interferenz mit dem QS-System bei der frühen Biofilmbildung bei niedrigeren Ag-NP-Konzentrationen deutlich ausgeprägt, als für die Beeinflussung des etablierten Biofilms erforderlich waren.

Derzeit geht man davon aus, dass Ag-NPs dadurch wirken, dass sie die Integrität und Membran der Bakterienzellwände zerstören, die Permeabilität der Membran erhöhen und den Zelltod fördern73. Darüber hinaus stören die Ag-NPs die Reaktion der Atmungskette, indem sie sich mit Sulfhydrylgruppen verbinden, was eine Lipidperoxidation verursacht und eine oxidative Schädigung der DNA und relevanter Proteine ​​begünstigt, woraufhin der Zelltod eintritt74,75. Ag-NPs haften auch an schwefelhaltigen und phosphorhaltigen DNA-Gruppen, was letztendlich die DNA schädigen und ihre Transkription und Translation beeinträchtigen kann76. Darüber hinaus unterbrechen Ag-NPs die Zellsignalübertragung und lösen den Zelltod durch die Dephosphorylierung von Phosphotyrosinen aus77. Wenn Ag-NPs aeroben Bedingungen ausgesetzt werden, können sie Ag+ von der Oberfläche der Partikel freisetzen. Das freigesetzte Ag+ hat eine erhebliche antimikrobielle Wirkung, da es mit den Zellwänden und Membranen der Bakterien interagiert. Dies ist einer der Hauptgründe für die Toxizität von Ag-NPs78.

Obwohl Ag-NPs großes Potenzial haben, als antimikrobielle Wirkstoffe zu dienen, bestehen Bedenken hinsichtlich ihrer Sicherheit beim Menschen und der Entwicklung einer Silberresistenz bei Bakterien, einschließlich Pseudomonas. Das zytotoxische Potenzial von Ag-NPs hat ihre Etablierung als vielversprechende Chemotherapeutika behindert. Siddique et al.79 untersuchten das toxische Potenzial von Ag-NPs gegenüber HeLa-Zelllinien in verschiedenen Konzentrationen mithilfe des Neutralrot-Aufnahmetests. Ihre Ergebnisse ergaben, dass diese NPs bis zu Konzentrationen von 120 μg/ml ungiftig waren und dass statistisch signifikante zytotoxische Wirkungen bei einer Konzentration von 240 μg/ml auftreten – einer höheren Konzentration als in unserer vorliegenden Arbeit verwendet. Darüber hinaus lag die toxische Konzentration von Ag-NPs in Studien, in denen die Auswirkungen von Ag-NPs auf die menschliche Zellkultur in vitro untersucht wurden, zwischen 10 und 100 µg/ml80,81,82. In unserer Arbeit wurde keine statistisch signifikante Hemmung festgestellt, als wir die Zelllinie HT29-MTX mit den biosynthetisierten Ag-NPs in ähnlichen Konzentrationen in Kontakt brachten, was darauf hindeutet, dass die Ag-NPs sicher sein könnten, wenn sie in geringen Mengen verwendet werden.

Die Entstehung einer bakteriellen Resistenz gegen Silber durch den horizontalen Gentransfer83 von Bakterien ist ein ernstes Problem, das durch die zunehmende Verwendung von Silber in der Medizin und Industrie sowie in antimikrobiellen Mitteln für den Haushalt entstanden ist. Einige Studien haben gezeigt, dass PA84 und andere Bakterienarten85,86 in der Lage sind, lösliches Ag+ durch einen noch unbekannten Reduktionsprozess zu kolloidalem Ag oder NP Ag0 zu reduzieren12. Muller und Merrett86 haben vorgeschlagen, dass Ag+ von Bakterien aus der Umgebung entfernt wird, bevor es in die Zelle eindringen kann, wodurch die Notwendigkeit einer Protein-Silber-Bindung und Zellausflussprozesse verringert wird. Die zerstörerische und hemmende Wirkung von Silber auf Biofilme verhindert nicht vollständig, dass sich die Biofilme sowohl in NAg- als auch in ionischer Ag+-Form an Silber anpassen. Dennoch bleibt Silber im Vergleich zu häufig verwendeten Antibiotika ein wirksames Antibiofilmmittel87,88.

Bei der Untersuchung der bakteriziden Wirkung von Ag-NPs zeigten bestimmte PA-Stämme bei niedrigeren Konzentrationen eine unerwartete Wachstumssteigerung (Abb. 3). In früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass AgNO3-Konzentrationen unter bakteriziden Werten (3–8 µg/l) das Wachstum von E. coli eher stimulieren als hemmen89. Ähnliche Ergebnisse wurden von Schacht et al.90 erzielt, wobei festgestellt wurde, dass Ag-NPs mit einer Größe von weniger als 15 nm und in Konzentrationen zwischen 20 und 60 µg/ml das Wachstum einiger Bakterien stimulieren. Ag-NPs mit einer Größe von 2,8–10,5 nm, die mit Polyethylenglykol beschichtet sind, wurden von Xiu et al. 89, um das Wachstum von E. coli K12 bei Konzentrationen von 1,8–2,2 µg/ml von 6 auf 13 % zu steigern. Die Autoren fanden außerdem heraus, dass Ag-NPs mit einer Größe von 20–80 nm und einer Beschichtung mit Polyvinylpyrrolidon das Wachstum von E. coli bei Konzentrationen von 5,7–16,4 µg/ml von 11 auf 21 % steigerten.

Ein erhöhtes oder stimuliertes Wachstum von Organismen unter subletaler Exposition gegenüber Hemmstoffen ist eine zweiphasige Dosisreaktion, die als hormetische Reaktion bekannt ist. Das charakteristische Reaktionsmuster von Mikroben besteht in einem stimulierten Wachstum bei niedrigen Konzentrationen des Inhibitors und einem gehemmten Wachstum bei hohen Konzentrationen 91. Studien über die Wirkung von Antibiotika auf Bakterien, die hormetische Reaktionen zeigten, kamen zu dem Schluss, dass sie einen neuartigen Überlebensmechanismus darstellen, der zu exponentiellem Wachstum führen kann bei geringen Antibiotikakonzentrationen. Hormetische Reaktionen wurden auch in Bezug auf NPs untersucht87,92, aber derzeit ist kaum bekannt, wie sie in Bakterienzellen erreicht werden. Die aktuellen Autoren haben versucht, diese unerwarteten Wachstumssteigerungen durch Bezugnahme auf einen nichtgenetischen Prozess zu erklären, der als „Persistenz“ bekannt ist.

Bei diesem Mechanismus handelt es sich um Subpopulationen von Zellen (Persisterzellen), die weniger von antibakteriellen Wirkstoffen betroffen sind und daher länger überleben als andere anfälligere Subpopulationen 93. In Umgebungen mit geringen Konzentrationen an Ag-NPs (Ag+) hat der Abwehrmechanismus der Bakterienzellen ausreichend Zeit um sich an die toxischen Wirkungen von Ag-NPs anzupassen. Die „SOS“-Reaktion 94 des DNA-Reparatur-Regulierungsnetzwerks wird dann durch die Anhäufung fehlerhafter einzelsträngiger DNA in der Zelle ausgelöst, die durch die genotoxischen Wirkungen von Ag NP verursacht wird.

Unsere Studie ergab, dass Ag-NPs das Wachstum reduzieren, die Bildung von Biofilmen verhindern und etablierte PA-Biofilme beseitigen können. Diese Ergebnisse unterstreichen die vielversprechende Zukunft von Ag-NPs für den Einsatz als alternative antimikrobielle Wirkstoffe oder in Verbindung mit Antibiotika. Die Entwicklung einer Silberresistenz gibt jedoch weiterhin Anlass zur Sorge. Daher wird empfohlen, dass sich die Forschung auf die Untersuchung der kombinierten Wirkung von Ag-NPs und Antibiotika konzentriert, um zu verstehen, wie sie gegen verschiedene Mikroorganismen, insbesondere gegen resistente Krankenhausstämme, wirken. Mit der Zeit könnten Ag-NPs zu einer wirksamen alternativen Therapie zur Bekämpfung von Infektionen werden. Die strategische Kontrolle und Behandlung von Biofilminfektionen wird einfacher, je besser wir den Mechanismus der Biofilmbildung verstehen. Die QS-Signalkaskade beeinflusst eine Vielzahl bakterieller Aktivitäten, einschließlich Pathogenität und Biofilmbildung95. Durch die Blockierung der QS-Kaskaden kann die bakterielle Pathogenität und Virulenz verringert werden. Weitere Forschung ist erforderlich, um den molekularen Mechanismus von Ag-NPs und QSI bei der Verhinderung der PA-Biofilmentwicklung zu bestätigen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

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Muna Almasri, Dua'A. Al Balawi, Lugain Ibrahim und Hadeel Albalawi

Abteilung für Pharmazeutik und pharmazeutische Technologie, Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften, The Hashemite University, Zarqa, Jordanien

Nur gehamed

Nanotechnology Institute, Jordan University of Science & Technology, PO Box 3030, Irbid, 22110, Jordanien

Borhan Aldeen Albiss

Leiter des Mikrobiologielabors, Abteilung für Labormedizin, Jordan University Hospital, Amman, Jordanien

Nour Aldabaibeh

Abteilung für medizinische Grundlagenwissenschaften, Medizinische Fakultät, Al-Balqa' Applied University, AL-Salt, Jordanien

Sameer Al Haj Mahmoud

Abteilung für Pädiatrie, Medizinische Fakultät, Haschemitische Universität, Zarqa, Jordanien

Aus China

Institute of Cellular Medicine und Cell & Molecular Biosciences, Newcastle University Medical School, Newcastle University, Newcastle Upon Tyne, NE2 4HH, Großbritannien

Matthew Wilcox und Christopher Ward

Abteilung für Pflanzenproduktion und -schutz, Fakultät für Landwirtschaft, Universität Jerash, Jerash, Jordanien

Muayyad Bani-Hani

Biowissenschaftliches Institut, Medizinische Fakultät, Newcastle University, Newcastle Upon Tyne, NE2 4HH, Großbritannien

Muneef Aldhafeeri, Matthew Wilcox und Jeffrey Pearson

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SCHINKEN. war für das Studiendesign, die formale Analyse und die Untersuchung verantwortlich und beaufsichtigte DA, MA, LI und HAB bei der Durchführung der Experimente. SCHINKEN. vorbereitete Zahlen und Texte – Originalentwurf. DA, MA, LI und HAB: Alle sind Forschungsassistenten und verantwortlich für die Durchführung der Experimente unter Aufsicht von HA-MNA und MK, verantwortlich für die Isolierung und Identifizierung klinischer PA-Stämme. BA, SH, MA und SA: verantwortlich für die Biosynthese von Silbernanopartikeln und die Charakterisierung von Nanopartikeln. BA erstellte Abb. 1. MB: Unternahm die formale Identifizierung des in dieser Studie verwendeten Peganum harmala. AK, MW, JP und CW, verantwortlich für das Studiendesign, haben das Manuskript gemeinsam geschrieben.

Korrespondenz mit Hafez Al-Momani.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Al-Momani, H., Almasri, M., Al Balawi, D. et al. Die Wirksamkeit biosynthetisierter Silbernanopartikel gegen Pseudomonas aeruginosa-Isolate von Mukoviszidose-Patienten. Sci Rep 13, 8876 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35919-6

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Eingegangen: 23. Februar 2023

Angenommen: 25. Mai 2023

Veröffentlicht: 01. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35919-6

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